m6A-SAC-seq在单核苷酸分辨率水平检测RNA m6A修饰

摘要：

目的 建立m6A特异性烯丙基标记测序(m6A-selective allyl chemical labeling and sequencing,m6A-SAC-seq)实验方法体系,在单核苷酸分辨率水平对RNA的N6-甲基腺苷(m6A)修饰进行检测.方法 m6A烯丙基标记测序(m6A-SAC-seq)使用特异性甲基转移酶MjDim1对m6A添加烯丙基标记成为N6-烯丙基-甲基腺苷(am6A),使用I2 处理产生N1,N6-环化腺苷(A)产物,在逆转录时引入突变,从而实现在单核苷酸分辨率水平的检测.通过HPLC法纯化甲基转移酶MjDim1,使用探针及液相色谱-质谱联用系统(LC-MS/MS)检测m6A的转换率,计算MjDim1活性作为质控.提取样品RNA,用烯丙基标记m6A,并用m6A-SAC-seq技术构建文库,测序后通过数据分析得到m6A位点信息,通过标准曲线校准计算得到m6A的含量.结果 m6A-SAC-seq处理后,HIV逆转录酶识别环化的am6A位点,引入突变,但附近未修饰位点不发生突变.通过特定的A突变成T/C的突变位置(A to T/C)来识别m6A位点,并添加内参探针,用标准曲线来定量m6A含量.结论 m6A-SAC-seq技术仅需30 ng的mRNA或去除了rRNA的总RNA样本就可以实现m6A位点在单核苷酸分辨率水平的检测.

关键词：RNA甲基化、m6A甲基化、单核苷酸分辨率、m6A-SAC-seq、测序方法

所属期刊栏目：50

分类号：Q3-3

资助基金：国家重点研发计划2021YFA1100400

在线出版日期：2023-06-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：439-446