慢病毒shRNA靶向干扰RegⅣ基因胰腺癌细胞株的构建

摘要：

目的 构建并鉴定再生基因4 (regenerating islet-derived family member 4,RegⅣ)短发夹干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,继而建立稳定干扰RegⅣ基因表达的胰腺癌细胞株PANC-1.方法 使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测RegⅣ基因在胰腺癌细胞株中的表达情况.构建重组靶向干扰RegⅣ基因的shRNA慢病毒表达质粒pGC-shRNA-RegⅣ,用脂质体转染的方法将载体导入胰腺癌细胞,建立稳定表达shRNA的细胞株.使用荧光定量PCR检测干扰效率.RegⅣ基因过表达载体的构建方法为:将获取的目的基因与pEGFP-RegⅣ-3FLAG过表达质粒载体分别进行双酶切,利用电泳回收双酶切产物,转化感受态细胞并进行测序验证,验证成功后,使用Western blot检测其在293T细胞中的表达强度.结果 PCR结果显示RegⅣ在PANC-1中表达最高,在BxPC-3中表达最低.测序验证pGC-shRNA-RegⅣ重组质粒构建成功.将重组质粒稳定转染入胰腺癌细胞株PANC-1后能明显抑制RegⅣmRNA表达水平.过表达载体pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ合成成功后进行Western blot鉴定,验证pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ过表达载体构建成功.过表达RegⅣ基因转染BxPC-3后,与空质粒组相比,RegⅣ表达量明显提高.结论 成功建立了靶向稳定干扰RegⅣ基因表达的shRNA胰腺癌细胞株PANC-1.

关键词：胰腺癌、再生基因4、慢病毒、短发夹干扰RNA

所属期刊栏目：43

分类号：R576(消化系及腹部疾病)

资助基金：国家自然科学基金81472578;上海市科学技术委员会基金11JC1410000;the National Natural Science Foundation of China81472578;Science and Technology Commission of Shanghai Municipality,China11JC1410000

在线出版日期：2016-07-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：147-153