PTD-Calbindin D28K融合蛋白的表达、纯化及其穿膜功能的鉴定

摘要：

目的构建融合蛋白PTD-Calbindin D28K(CaBP28)的表达质粒,并进行诱导表达、纯化,在体外初步鉴定其跨膜转运功能.方法提取大鼠脑组织总RNA,反转录后用聚合酶链反应(PCR)法扩增编码CaBP28的全长cDNA序列,重组入pET-32a及含有PTD的pTransVector表达载体中,测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),构建重组体的表达菌株.IPTG诱导表达后,以NTA-Ni亲和层析柱进行分离纯化,SDS-PAGE以及Western blot鉴定.纯化的CaBP28及PTD-CaBP28用FITC标记,分别以一定的浓度孵育体外培养的cos7细胞,最后荧光显微镜下观察两者在细胞中的分布情况,并用流式细胞仪(FCM)做定量分析.结果成功地构建了含有及不含有PTD的CaBP28表达载体,插入片断783 bp,表达产物相对分子质量分别约30 000、50 000,经Wetern blot鉴定,与抗CaBPD28K抗体均有特异性反应.孵育培养的cos7细胞后,CaBP28-FITC仅少量吸附于细胞膜表面,而PTD-CaBP28-FITC则分布于胞质内;FCM定量分析发现,细胞荧光强度随着目的蛋白的孵育浓度或孵育时间增加而增加,并且孵育时间为1 h时荧光达到最强.结论重组PTD-CaBP28具有良好的细胞穿膜功能.

关键词：蛋白质转导域、钙结合蛋白D28K、蛋白质治疗

所属期刊栏目：31

分类号：R743.3(神经病学与精神病学)

在线出版日期：2004-07-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：231-234