树鼩脊髓微血管内皮细胞的分离培养及EV71感染实验

摘要：

目的 建立树鼩脊髓来源的微血管内皮细胞体外分离培养技术,用71型肠道病毒(enterovirus 71,EV71)感染该细胞,探讨其感染特性,为EV71损伤中枢神经系统机制的研究提供基础.方法 采用Ⅱ型胶原酶、分散酶、DNase Ⅰ三酶联合两次消化树鼩脊髓组织后,获取微血管内皮细胞,并进行纯化和鉴定.用EV71感染树鼩脊髓微血管内皮细胞,测定感染不同时间点的细胞及其培养上清液中病毒载量.采用间接免疫荧光法检测细胞中EV71标志蛋白的表达,以确定EV71对树鼩脊髓微血管内皮细胞的感染性.结果 分离培养获得的树鼩脊髓微血管内皮细胞呈典型的分支状和串珠状,经过嘌呤霉素纯化培养后的传代细胞主要是不规则的多角状细胞;细胞免疫荧光鉴定结果显示,微血管内皮细胞标志蛋白CD31和血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)表达都呈阳性.用感染复数为1的EV71感染树鼩脊髓微血管内皮细胞,可见典型的细胞病变,且病毒滴度可达3.2×106 TCID50/mL,表明EV71可成功感染树鼩脊髓微血管内皮细胞并有效增殖;而且在48h内,细胞培养上清液中病毒载量呈线性升高,而细胞中病毒载量在12 h到达顶峰.间接免疫荧光法在EV71感染后12 h的树鼩脊髓微血管内皮细胞质中可检测到病毒颗粒.结论 成功建立了树鼩脊髓微血管内皮细胞体外分离培养方法,确定了 EV71对树鼩脊髓微血管内皮细胞的感染性和病毒增殖特性,为开展EV71入侵中枢神经系统的机制研究提供了一定基础.

关键词：脊髓微血管内皮细胞、分离培养、EV71、病毒增殖、树鼩

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分类号：R-332;Q95-33(医学研究方法)

资助基金：云南省应用基础研究计划;国家自然科学基金;云南省科技计划;平台计划项目;昆明市科技创新团队项目

在线出版日期：2021-06-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：148-154