基于CRISPR/Cas9技术构建NPHP1基因敲除的肾集合管上皮细胞

摘要：

目的 利用CRISPR/Cas9技术构建NPHP1基因敲除的肾集合管上皮细胞,为肾单位肾痨(NPHP)发病机制的研究提供体外细胞模型.方法 针对犬NPHP1第5外显子区域设计3对引导RNA序列(sgRNA),构建重组真核表达载体PX459-sgRNA;以脂质体Lipo2000转染犬肾集合管上皮细胞MDCK,嘌呤霉素筛选成功转染细胞.基因测序和脱靶检测以验证敲除位点,分别采用RT-qPCR和Western blotting法检测敲除靶基因的mRNA和蛋白,显微镜下观察细胞形态变化.以慢病毒转染shRNA敲低NPHP1基因表达的MDCK细胞为对照,同法检测敲低靶基因的蛋白,并观察细胞形态.结果 3对sgRNA通过重组真核表达载体,成功转染MDCK细胞.筛选获得1株NPHP1稳定敲除的MDCK细胞,基因测序显示为小片段缺失与移码点突变的复合杂合突变[c.500_551del(p.His167GlnfsTer14)和c.499delC(p.His167ThrfsTer31)].基因测序显示,8个可能脱靶位点与原位点测序一致,排除脱靶情况.CRISPR/Cas9技术构建NPHP1基因敲除的MDCK细胞NPHP1 mRNA表达下降,NPHP1基因编码蛋白nephrocystin-1表达完全缺失;shRNA技术构建NPHP1基因敲低的MDCK细胞nephrocystin-1表达减低.MDCK细胞聚集分布,呈铺路石样改变;两种技术构建的MDCK细胞外形改变类似,略呈长梭形,细胞间隙稍增大.结论 利用CRISPR/Cas9技术成功构建了NPHP1基因稳定敲除的MDCK细胞,将有利于NPHP发病机制的体外研究.

关键词：肾单位肾痨、NPHP1基因、CRISPR/Cas9技术、基因敲除

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分类号：R692.9(泌尿科学（泌尿生殖系疾病）)

资助基金：国家自然科学基金项目81470913;81670610

在线出版日期：2020-07-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：21-25,115