Smad真核表达质粒构建及其在小鼠T淋巴瘤细胞中的表达

摘要：

目的 构建并鉴定pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3及pcDNA3.1-Smad4真核表达质粒,探讨Smad在小鼠T淋巴瘤细胞(EL4)中能否稳定表达.方法 以EL4细胞cDNA为模板,PCR法获取转录因子Smad2、Smad3、Smad4 mRNA CDS区即目的基因片段;构建含有目的基因的T载体pMD19-T-Smad2、pMD19-T-Smad3、pMD19-T-Smad4;用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切pcDNA3.1载体、pMD19-T-Smad2,用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切pcDNA3.1载体、pMD19-T-Smad3及pMD19-T-Smad4,T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,扩大培养并提取重组质粒;通过PCR、双酶切及DNA测序等方法鉴定重组质粒.将构建好的pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3、pcDNA 3.1-Smad4电转入EL4细胞,72 h后用Western blotting法检测EL4细胞中目的蛋白的表达.结果 PCR和双酶切结果均提示重组质粒pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3、pcDNA 3.1-Smad4构建成功;测序结果确定插入片段无突变,序列完全正确.重组质粒pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3、pcDNA3.1-Smad4转入EL4细胞后上调目的蛋白Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表达.结论 成功构建pcD-NA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3和pcDNA3.1-Smad4真核表达质粒;将Smad真核表达质粒成功转染入EL4细胞,诱导细胞内目的蛋白高表达.

关键词：T淋巴瘤细胞、Smad蛋白、真核表达质粒

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分类号：R733.4(肿瘤学)

资助基金：国家自然科学基金资助项目81401683;南通大学高等教育研究课题2017GJ015;南通大学医学院大学生创新训练计划项目yxy201610

在线出版日期：2018-07-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：9-12