人DNMT3A基因慢病毒载体构建及其乳腺癌细胞MDA-MB-231稳定表达株的建立

摘要：

目的 构建人类DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)蛋白过表达慢病毒载体并建立乳腺癌细胞MDA-MB-231稳定表达株.方法 从乳腺癌细胞MDA-MB-231中提取总RNA,逆转录出含DNMT3A的cDNA;以DNMT3A的cDNA为模板,根据其CDS序列设计含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶位点的引物序列,采用PCR法扩增出带有双酶切位点的目的基因;采用双酶切法将目的片段连接到到慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Hyg中,获得重组的pLVX-FLAG-DNMT3A表达载体.重组的pLVX-FLAG-DNMT3A表达载体通过与包装质粒共转染293T细胞,获得携带FLAG-DNMT3A的重组慢病毒.以慢病毒感染MDA-MB-231细胞,48 h后在培养基中加入1μg/μL的嘌呤霉素,筛选出稳定表达DNMT3A蛋白的细胞株,检测稳定株及野生型细胞DNMT3A蛋白及mRNA表达水平.结果 构建的重组质粒经菌落PCR、重组质粒双酶切、质粒PCR验证及测序比对鉴定正确.用病毒感染MDA-MB-231细胞,药物筛选后获得的过表达稳定株中,DNMT3A蛋白及mRNA表达水平分别为13.2±0.48、107.10±0.46,均高于野生型及空载对照.结论 成功构建了DNMT3A基因慢病毒表达载体pLVX-FLAG-DNMT3A,并在MDA-MB-231细胞中筛选出稳定表达DNMT3A的细胞株,为进一步探讨DNMT3A在乳腺癌中的作用提供了体外细胞系模型.

关键词：DNMT3A基因、慢病毒载体、MDA-MB-231细胞、乳腺癌

所属期刊栏目：57

分类号：Q591.2;Q784

资助基金：国家自然科学基金资助项目81672592,81202102

在线出版日期：2017-12-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：5-8