过表达和敲除SLUG基因卵巢癌SKOV3细胞稳定株的建立

摘要：

目的 利用慢病毒载体和改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统分别构建过表达和敲除SLUG基因的卵巢癌SKOV3细胞稳定株.方法 ①以质粒pCMV-Myc-SLUG为模板扩增出HA-SLUG基因,将其连接到慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Hyg中.将此重组表达载体pLVX-HA-SLUG通过病毒感染法感染SKOV3细胞(实验组),以相同条件制备pLVX-IRES-Hyg空载体的慢病毒作为阴性对照,Western blotting法检测两组SLUG蛋白表达.②将一对能特异结合SLUG基因的sgRNA分别连接到载体PX462中,获得的一对重组质粒通过脂质体法共转染SKOV3细胞,筛选稳定株,挑取单克隆细胞(实验组),用Western blotting法检测SLUG蛋白表达,另设空白对照组,不加任何处理.结果 ①对挑取的单克隆菌液进行PCR扩增,阳性者提取质粒进行PCR和双酶切,两者验证正确后进行DNA测序鉴定,结果证实重组质粒构建成功.阴性对照组与实验组SLUG蛋白相对表达量分别为0.92±0.02和3.14±0.04,实验组SLUG蛋白表达高于阴性对照组(P<0.01).②挑取4个单克隆细胞进行测定,SLUG蛋白的相对表达量分别为0.07±0.01、0.06±0.01、0.21±0.02、0.20±0.01,空白对照组为0.56±0.03.实验组SLUG蛋白相对表达量低于空白对照组(P均<0.01).结论 过表达和稳定敲除SLUG基因的SKOV3细胞株构建成功,为进一步探讨SLUG在卵巢癌中的作用提供了细胞模型.

关键词：SLUG基因、慢病毒载体、SKOV3细胞、卵巢癌、细胞模型

所属期刊栏目：57

分类号：R737.31(肿瘤学)

资助基金：天津市自然科学基金资助项目17JCQNJC12600

在线出版日期：2017-12-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

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