稳定表达 Notch1胞内结构域肺腺癌细胞株的构建及鉴定

摘要：

目的：构建Notch1胞内结构域（ N1ICD）稳定表达的肺腺癌A549细胞株。方法采用PCR方法扩增N1ICD基因，构建慢病毒重组质粒pHBLV-N1ICD-ZsGreen-Puro（LV-N1ICD），采用PCR和基因测序鉴定重组质粒。高纯度无内毒素抽提慢病毒重组质粒和辅助包装原件载体质粒，使用慢病毒空载质粒（ LV-ZsGreen-Puro）和LV-N1ICD共转染293T细胞包装慢病毒，利用药物筛选法测定病毒滴度。将A549细胞分成A549-N1ICD组和A549-ZsGreen-Puro组，分别加入LV-N1ICD和LV-ZsGreen-Puro，取制备好的慢病毒感染A549细胞，加入嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株，荧光显微镜观察转染效率，以带有绿色荧光的细胞初步视为稳定转染的细胞株。以A549细胞为对照组，进一步采用qPCR和Western blot方法分别检测N1ICD mRNA及蛋白表达。结果 PCR及基因测序结果表明pHBLV-N1ICD-ZsGreen-Puro重组质粒构建成功。 LV-N1ICD组病毒滴度为1×108 TU／mL，LV-ZsGreen-Puro组病毒滴度为1×108 TU／mL。经嘌呤霉素筛选后，荧光显微镜下观察细胞形态无明显变化，A549-ZsGreen-Puro组和A549-N1ICD组70％～80％的细胞带有绿色荧光。对照组、A549-ZsGreen-Puro组、A549-N1ICD组的N1ICD mRNA相对表达量分别为1．59±0．11、1．09±0．10、70．81±6．39，A549-N1ICD组高于其他两组（P均＜0．01）。三组N1ICD蛋白相对表达量分别为1．99±0．13、1．73±0．08、6．58±0．43，A549-N1ICD组高于其他两组（P均＜0．01）。结论成功构建了稳定表达N1 ICD的肺腺癌A549细胞株。

关键词：肺腺癌、Notch蛋白、胞内结构域、慢病毒重组质粒

所属期刊栏目：57

分类号：R734.2(肿瘤学)

资助基金：国家自然科学基金资助项目81570262；江西省研究生创新专项资金YC2015-B009。

在线出版日期：2017-03-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：5-8