Six2基因shRNA敲减慢病毒表达载体及其稳定细胞株的构建

摘要：

目的：筛选并包装Six2基因shRNA敲减的慢病毒，建立稳定表达敲减Six2基因的黑质多巴胺能神经元MES23．5细胞系。方法合成三种（分别命名为pLV-shSix2-1、pLV-shSix2-2、pLV-shSix2-3）含敲减Six2基因干扰序列的双链DNA oligo，并将其连接于含有嘌呤霉素抗性的pLV-H1-EF1a载体质粒，均采用慢病毒包装四质粒系统（pRRE/pVSVG/pREV/pLV）包装并转染腺病毒 E1A 基因的人肾上皮细胞系（293T 细胞）以获取慢病毒 pLV-shSix2。收集敲减Six2基因的pLV-shSix2-1、pLV-shSix2-2、pLV-shSix2-3慢病毒质粒及对照质粒上清，感染黑质多巴胺能神经元细胞（MES23．5细胞），分别设为pLV-shSix2-1组、pLV-shSix2-2组、pLV-shSix2-3组及对照组，Western blot法检测各组细胞 Six2蛋白表达，鉴定各组Six2干扰序列的敲减效果。嘌呤霉素法筛选稳定敲减 Six2的MES23．5细胞株。结果酶切结果表明在262 bp及约9000 bp处分别有明显条带，测序结果显示所测序列与敲减的Six2干扰序列完全一致。 Western blot结果显示干扰序列shSix2-2对应的细胞中Six2蛋白表达显著降低，shSix2-1和shSix2-3蛋白表达降低效果不明显。用嘌呤霉素筛选病毒感染的pLV-shSix2-2组细胞系成功。结论成功构建并筛选了Six2基因shRNA敲减慢病毒表达载体，建立了稳定敲减Six2基因的MES23．5细胞株。

关键词：Six2、胶质细胞系源性神经营养因子、慢病毒、载体构建、基因敲减

分类号：R394.3;R742.5

资助基金：国家自然科学基金资助项目31040035。

在线出版日期：2014-12-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：4-7