10.3969/j.issn.1002-266X.2014.42.002
Six2基因shRNA敲减慢病毒表达载体及其稳定细胞株的构建
目的:筛选并包装Six2基因shRNA敲减的慢病毒,建立稳定表达敲减Six2基因的黑质多巴胺能神经元MES23.5细胞系。方法合成三种(分别命名为pLV-shSix2-1、pLV-shSix2-2、pLV-shSix2-3)含敲减Six2基因干扰序列的双链DNA oligo,并将其连接于含有嘌呤霉素抗性的pLV-H1-EF1a载体质粒,均采用慢病毒包装四质粒系统(pRRE/pVSVG/pREV/pLV)包装并转染腺病毒 E1A 基因的人肾上皮细胞系(293T 细胞)以获取慢病毒 pLV-shSix2。收集敲减Six2基因的pLV-shSix2-1、pLV-shSix2-2、pLV-shSix2-3慢病毒质粒及对照质粒上清,感染黑质多巴胺能神经元细胞(MES23.5细胞),分别设为pLV-shSix2-1组、pLV-shSix2-2组、pLV-shSix2-3组及对照组,Western blot法检测各组细胞 Six2蛋白表达,鉴定各组Six2干扰序列的敲减效果。嘌呤霉素法筛选稳定敲减 Six2的MES23.5细胞株。结果酶切结果表明在262 bp及约9000 bp处分别有明显条带,测序结果显示所测序列与敲减的Six2干扰序列完全一致。 Western blot结果显示干扰序列shSix2-2对应的细胞中Six2蛋白表达显著降低,shSix2-1和shSix2-3蛋白表达降低效果不明显。用嘌呤霉素筛选病毒感染的pLV-shSix2-2组细胞系成功。结论成功构建并筛选了Six2基因shRNA敲减慢病毒表达载体,建立了稳定敲减Six2基因的MES23.5细胞株。
Six2、胶质细胞系源性神经营养因子、慢病毒、载体构建、基因敲减
R394.3;R742.5
国家自然科学基金资助项目31040035。
2014-12-05(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)
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