siRNA抑制转化生长因子-β1对小鼠黄韧带骨化的影响

摘要：

目的 运用RNA干扰(RNAi)技术抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)在小鼠黄韧带成纤维细胞中的表达,探讨其对脊柱黄韧带骨化的影响.方法 培养小鼠黄韧带成纤维细胞,经人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)诱导骨化,对骨化成功的黄韧带细胞(成骨细胞)进行形态学观察,并对其进行碱性磷酸酶(ALP)染色及钙结节茜素红染色鉴定;构建靶向TGF-β1基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体(siRNA-pSilencer2.0U6-TGFβ1)并转染成骨细胞,分为3组:真核表达载体转染后细胞为实验组,空载体转染后细胞为阴性对照组,未转染细胞为空白对照组.应用免疫荧光技术检测转染前后细胞中TGF-β1、BMP-2的表达;RT-PCR检测TGF-β1 mRNA在细胞内表达变化;Western blotting检测TGF-β1和BMP-2蛋白在细胞内表达变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞中ALP、骨钙素(OC)水平的变化.结果 经诱导骨化成功后,小鼠黄韧带细胞形态学观察可见细胞ALP染色、钙结节茜素红染色均呈阳性,具有典型成骨细胞生物学特征.构建的siRNA表达载体对细胞转染后,免疫荧光检测显示TGF-β1和BMP-2荧光强度下降;RT-PCR检测显示实验组较阴性对照组和空白对照组TGF-β1 mRNA表达分别下降41.94％、47.82％,差异有统计学意义(P＜0.01);Western blotting检测显示实验组较阴性对照组和空白对照组TGF-β1/β-action蛋白表达比值分别下降35.88％、44.75％,差异有统计学意义(P＜0.01);BMP-2/β-action蛋白表达比值分别下降81.79％、86.06％,差异有统计学意义(P ＜0.01);ELISA检测显示实验组较阴性对照组和空白对照组ALP分别下降24.14％、32.30％,差异有统计学意义(P＜0.01);OC分别下降17.01％、21.63％,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 构建靶向TGF-β1基因的siRNA真核表达载体能够有效抑制成骨细胞中TGF-β1以及内源性BMP-2表达,达到抑制脊柱黄韧带骨化的目的.

关键词：骨化、骨钙素、碱性磷酸酶、转化生长因子-β1、骨形态发生蛋白-2、小干扰RNA

所属期刊栏目：52

分类号：R686.5(骨科学（运动系疾病、矫形外科学）)

资助基金：山东省自然科学基金Y2007C046

在线出版日期：2016-11-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：27-33