海带配子体中孢子形成相关蛋白(SRP)基因的克隆及其原核表达
从已构建好的海带雄配子体抑制消减cDNA文库中,通过Southern点杂交及序列分析,发现一未知功能的差异表达基因片段(克隆b9).首先根据该克隆序列设计基因特异性引物,利用cDNA末端快速扩增技术,自雄配子体中克隆了一条长831 bp的cDNA序列,其中开放阅读框450民bp,5'-非翻译区182 bp,3'-非翻译区199 bp且具有明显的poly(A)尾巴.同样利用PCR方法自雌配子体中克隆了该基因的cDNA序列,它与雄配子体的完全一致.蛋白同源搜索结果显示,该基因编码蛋白与点形念珠藻含有SpoIID/LytB结构域蛋白(SpoIID/LytB domain-containing protein:一种孢子形成时起作用的蛋白质)具有30%相似性,故暂命名为孢子形成相关蛋白基因(sporulation-related protein gene,srp)(GenBank登录号:EF490313).然后构建了srp基因原核表达载体pET-28a-srp,并将其转化至大肠杆菌BL21中进行表达,获得了分子量大小约19.3ku的目的蛋白,且表达量与诱导物IPTG的量成正比.通过高效液相色谱-质谱分析证实,重组蛋白的氨基酸序列与推测的目的蛋白一致.最后纯化重组了SRP蛋白并制备其多克隆抗体,利用该抗体并运用Western印迹技术,在海带配子体中证实SRP蛋白的存在.
海带、配子体、srp基因、原核表达、高效液相色谱-质谱法
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Q785;S917(基因工程（遗传工程）)
上海市教育委员会海洋生物学重点学科项目;教育部重点实验室基金;国家自然科学基金
2010-12-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
1165-1173
