可诱导稳定表达大电导钙激活钾通道的细胞系构建及蛋白质纯化
目的:旨在构建稳定表达人大电导钙激活钾通道(BKCa)的稳定细胞系并对重组蛋白分离纯化.方法:利用基因工程技术将人肠系膜动脉平滑肌BKCa编码基因克隆到表达载体pcDNA5/FRT/TO/FLAG,并转染Flp-InTMT-RExTM-293宿主细胞,用潮霉素B筛选建立稳定表达的单克隆细胞系.BKCa-pcDNA5-293细胞系经四环素诱导后,用anti-FLAG抗体对表达的BKCa蛋白质进行纯化.用western blot检测BKCa通道蛋白质的表达,用单通道膜片钳检测通道的电生理特性.结果:BKCa-pcDNA5-293细胞系经四环素诱导后表达了高水平的BKCa-FLAG融合蛋白,BKCa通道电导值为213.39±9.52 pS(n=15,cell-attached)和225.72±10.61 pS(n=13,inside-out),BKCa通道具有典型的大电导特性、电压依赖性、Ca2+依赖性及IbTX敏感性,与在体的人肠系膜动脉平滑肌BKCa通道具有相同的特征.纯化后的BKCa蛋白质条带单一,纯度约为89%.结论:成功构建BKCa-pcDNA5-293细胞系并获得纯化的BKCa蛋白质,为进一步深入研究通道功能及药物筛选奠定了重要的基础.
稳定表达细胞系、BKCa重组蛋白质、膜片钳
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R54;R34
国家自然科学基金项目81173661;四川省教育厅项目11ZB224;四川省卫生和计划生育委员会130277;泸州市科技局项目编号:2014-S-446/8;泸州医学院院级课题资助
2017-07-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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