从少量人源粪便中分离隐孢子虫用于全基因组测序的研究

摘要：

目的 直接从少量人源粪便样本中分离、纯化隐孢子虫卵囊,提取并扩增DNA,使其浓度和纯度符合全基因组测序(WGS)要求.方法 2013年12月-2014年10月收集来自美国佛罗里达州、爱达荷州和缅因州11份少量人源隐孢子虫粪便样本,每份200 mg,使用免疫磁珠分离(IMS)进行纯化卵囊;2014年8-12月收集来自美国农业部52份牛源隐孢子虫粪便样本作为对照,每份2 000 mg,采用饱和蔗糖、氯化铯密度梯度离心法和IMS等方法纯化卵囊.均使用QIAamp DNA Mini试剂盒提取基因组DNA,然后采用REPLI-g MIDI试剂盒进行全基因组扩增(WGA);最后通过定量PCR(qPCR)对WGA产物进行评估.结果 11份人源隐孢子虫WGA产物的DNA浓度为68.00～257.80 ng/μL.qPCR对隐孢子虫小亚基rRNA基因(SSU rRNA)扩增显示,11个分离株的循环数阈值(Ct)范围为8.92～19.23,Ct值越小表明隐孢子虫基因组DNA浓度越高;其中有6个分离株Ct＜15,54.54％的分离株满足WGS要求.52份牛源隐孢子虫WGA产物的DNA浓度为27.20～1 333.30 ng/μL,WGA产物qPCR的Ct值范围为6.48～32.09,其中29个分离株Ct值＜15,55.76％的分离株满足WGS要求.直接对少量人源粪便样本使用IMS纯化和对大量牛源样本多步骤纯化后通过WGA,符合WGS要求的样本量之间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 直接对临床上少量人源隐孢子虫粪便样本进行IMS纯化卵囊,可使隐孢子虫基因组DNA浓度和纯度达到测序要求,该方法可用于临床少量样本的全基因组测序.

关键词：人源隐孢子虫、粪便样品、全基因组扩增、定量PCR、全基因组测序

所属期刊栏目：23

分类号：R382.3(医学寄生虫学)

资助基金：教育部国家留学基金;黑龙江省自然科学基金项目;省属高校基本科研业务费科研项目

在线出版日期：2023-05-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：292-295,316