美洲钩虫抗血小板聚集多肽NaHPI1的分离与活性鉴定

摘要：

目的 从美洲钩虫分离并重组制备一种含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)序列的库尼茨(Kunitz)型多肽-美洲钩虫血小板抑制剂1(NaHPI1),鉴定重组NaHPI1(rNaHPI1)对血小板聚集的抑制作用.方法 通过美洲钩虫成虫全长转录组测序获得NaHPI1完整cDNA序列,通过在线生物信息学网站检索氨基酸序列同源性蛋白并预测信号肽.根据NaHPI1氨基酸序列合成大肠埃希菌密码子偏爱的成熟肽编码基因序列,将该序列连接入表达质粒构建原核表达重组质粒,鉴定正确的重组质粒pET32a-sumo/NaHPI1,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,收集菌体超声破碎后,用Ni-NTA亲和层析纯化重组融合蛋白,并在层析柱上进一步用小泛素蛋白样修饰物(SUMO)蛋白酶切割融合伴侣,收集透析液获得rNaHPI1.体外检测rNaHPI1对凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集的抑制作用.结果 通过全长转录组测序获得了编码NaHPI1的全长mRNA,预测其完整编码框编码包括16个氨基酸组成的信号肽和81个氨基酸残基组成的成熟肽.NaHPI1为Kunitz型结构多肽,并在其最后1个半胱氨酸残基之后的羧基端具有RGD序列.利用大肠埃希菌表达系统成功表达并分离纯化获得了 rNaHPI1蛋白.10、20和40 μg/mL的rNaHPI1蛋白对ADP(20μmol/L)诱导的血小板聚集的抑制率分别为(17.35±2.77)％、(23.33±2.31)％、(30.94±2.03)％,对凝血酶(1 U/mL)诱导的血小板聚集的抑制率分别为(12.85±1.55)％、(20.28±1.17)％、(27.30±2.11)％.rNaHPI 1蛋白对凝血酶及ADP诱导的血小板聚集均有明显抑制作用,差异有统计学意义(P＜0.05),并呈一定的剂量依赖关系.结论 本研究分离并鉴定了美洲钩虫的血小板聚集抑制剂NaHPI1的抑制血小板聚集活性,其可能通过抑制血小板聚集而在钩虫吸血时发挥抗凝血作用.

关键词：美洲钩虫、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列、NaHPI1、血小板聚集抑制剂

所属期刊栏目：22

分类号：R383.13(医学寄生虫学)

资助基金：国家自然科学基金81171599

在线出版日期：2022-07-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：601-605