CRISPR/Cas9系统靶向沉默Fas基因在肝衰竭细胞凋亡机制中的作用

摘要：

目的 探讨利用CRISPR/Cas9敲除系统沉默Fas基因介导的细胞凋亡在肝衰竭发生机制的作用.方法 构建靶向Fas基因的CRISPR/Cas系统(pX330-Fas-G1)质粒并转染HepG2细胞(设非转染细胞HepG2为对照组),提取DNA后T7E1酶切法检测突变体;Western blotting检测Fas蛋白的表达.刀豆素A药物处理后MTT法检测细胞增殖,克隆增生法检测细胞增生,AnnexinV/PI荧光双染分析细胞凋亡情况.结果 T7E1酶切分析显示,pX330-Fas-G1质粒的Guide RNA在Fas基因组上产生了有效切割,切割效率为50％;同时Western blotting检测结果显示,pX330-Fas-G1质粒转染至HepG2细胞后,与空白质粒pX330-GFP组比较,Fas蛋白的表达降低,差异有统计学意义(P＜0.01).经刀豆素A药物诱导细胞凋亡后,MTT法测定pX330-Fas-G1质粒转染的HepG2细胞组活力值为(68.0±5.0)％,高于非转染细胞组的(51.5±5.8)％,差异有统计学意义(P＜0.05);克隆增生法检测结果显示,pX330-Fas-G1质粒转染的HepG2细胞组在细胞克隆形成数量为(128.8±5.1),高于非转染组的(100.0±9.3),差异有统计学意义(P＜0.05).给予刀豆素A药物处理诱导细胞凋亡后,通过Annexin V和PI双染色,采用流式细胞技术检测显示,经pX330-Fas-G1质粒转染后的细胞组有10.0％的细胞为凋亡细胞,低于对照组细胞的33.3％,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 CRISPR/Cas9系统可通过下调Fas基因的表达来抑制细胞凋亡的进展,为临床开展急性肝衰竭的基因治疗提供理论依据和技术支持.

关键词：CRISPR/Cas9、Fas、凋亡、肝衰竭

所属期刊栏目：19

分类号：R575.3(消化系及腹部疾病)

资助基金：深圳市科技委科技计划资助项目JCYJ20180306174928402;深圳市福田区卫生公益性科研计划资助项目FTWS2015014;深圳市科创委基础研究自由探索项目

在线出版日期：2019-06-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：434-437