过表达miR-19慢病毒载体的构建和鉴定

摘要：

目的 构建过表达miR-19a/19b(miR-19)基因的慢病毒载体pm19H2BmRFP.方法 依据miR-19(784 bp)的序列设计引物,以pMIG-miR-19a/19b为模板扩增目的片段miR-19,再经胶回收、酶切并纯化而获连接用目的片段.连接用pHIV-H2BmRFP载体采用内切酶Xba Ⅰ和HpaⅠ进行双酶切,获得粘性末端线性化片段并纯化.最后使用T4 DNA连接酶对纯化的线性化载体pHIV-H2BmRFP和miR-19片段进行定向连接,转化,次日挑选单菌落,提取质粒后行PCR和测序鉴定.所构建载体即为pm19H2BmRFP.参考文献方法进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;过表达miR-19和RFP的慢病毒感染293T细胞及肺腺癌细胞株A549-Luc以建立相应病毒感染体系.结果 PCR及测序结果证实成功构建了pm19H2BmRFP,过表达miR-19的慢病毒上清感染A549-Luc和293T细胞48 h后,荧光显微镜下均可观察到红色荧光.结论 成功构建过表达miR-19基因的慢病毒载体pm19H2BmRFP,为后续研究奠定基础.

关键词：miR-19、RFP、慢病毒载体

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分类号：R373.9(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)

在线出版日期：2014-09-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：850-852,封4