携带人miR302和EGFP基因慢病毒表达载体构建

摘要：

目的 构建携带人miR302和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体pFUM3GW.方法 Nhe Ⅰ和Not Ⅰ双酶切pmiR302ApE以释放miR302,接着补平酶切位点而获连接用miR302:BamH Ⅰ酶切携带EGFP的慢病毒载体pFUGW,接着补平酶切产物.并去磷酸化而获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的Solution Ⅰ将其与连接用miR302连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,PCR筛选正向阳性克隆,随后将选定的含有阳性克隆的单菌落摇菌,提取质粒并行酶切鉴定及对插入的miR302测序.所构建载体命名为pFUM3GW.获pFUM3GW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带miR302和EGFP基因的慢病毒感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和5-8F以建立相应病毒感染体系.结果 PCR、酶切和测序证实成功构建了pFUM3GW,按标准程序生产的携带miR302和EGFP基冈的慢病毒上清高效率感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)及鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和5-8F.结论 成功构建携带人miR302和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUM3GW,为相关后续研究打下了良好基础.

关键词：miR302、EGFP、慢病毒载体

所属期刊栏目：9

分类号：R34;R739.63(人体生物化学、分子生物学)

资助基金：国家自然科学基金委员会-广东省联合基金重点项目u0732006;国家自然科学基金30271177;广东省自然科学基金021903、9151063101000015;广东省医学科研基金A2007359;南方医科大学优秀中青年科技人才库科研资助金、广州地区科学仪器协作共用网专用基金2006176

在线出版日期：2009-12-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：977-979,封4