弓形虫SAG1成熟蛋白编码区基因在甲醇酵母中的初步表达

摘要：

目的分析弓形虫主要表膜蛋白SAG1在甲醇酵母高效表达系统表达的可行性.方法在5′端和3′端引物分别引入EcoRⅠ和SpeⅠ酶切位点,PCR扩增SAG1成熟肽编码区基因,定向克隆到甲醇酵母分泌型表达质粒pMETαA中,构建不带6个组氨酸尾序列的重组质粒.重组质粒被PacⅠ酶切下表达盒,氯化锂化学法转化腺嘌呤营养缺陷型毕赤甲醇酵母株PMD11和PMD16, 通过腺嘌呤营养缺陷型选择培养基YPD筛选酵母重组子,并利用MM/MD选择培养板分析外源基因表达盒整合到重组酵母染色体中的方式.筛选甲醇利用野生型的重组酵母,用甲醇诱导表达,并分析SAG1的表达水平,从中筛选高表达转化子.结果获得了经非同源重组整合到酵母染色体上的能有效利用甲醇作为唯一碳源的PMD11和PMD16转化株.在甲醇诱导后第3天,细胞裂解液SDS-PAGE检测开始出现分子量与目的蛋白预测分子量相同的蛋白带,但PMD11重组株中的该蛋白随培养时间延长而减少,而PMD16重组株中的目的蛋白量未见减少.上清中有40kDa和27kDa的两种蛋白,后者的量大于前者,并与SAG1成熟肽的大小一致,PMD16株的表达量大于PMD11株,总蛋白量约35μg/ml.结论弓形虫SAG1基因可在甲醇酵母表达系统中表达,但PMD11宿主菌会降解外源蛋白,而缺失了蛋白酶的PMD16宿主菌能比较高效地表达、分泌SAG1成熟蛋白.

关键词：弓形虫、SAG1、甲醇酵母

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分类号：R382.5(医学寄生虫学)

资助基金：广东省自然科学基金团队项目;广东省医药卫生科研项目;广东省广州市科研项目

在线出版日期：2004-02-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：330-333