沉默T细胞Cbl-b基因对4T1细胞免疫杀伤作用影响
目的 乳腺癌发生发展与机体免疫水平有密切关系,而Cbl-b基因可作为抗肿瘤治疗的免疫靶点.利用超声介导微泡破裂技术(ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)沉默T细胞Cbl-b基因表达,观察转染T细胞对4T1乳腺癌细胞的体外免疫杀伤效率.方法 磁珠分选纯化T细胞,构建靶向Cbl-b基因的短发夹RNA(short-hair-pin RNA,shRNA)表达质粒,超声微泡介导转染48 h后,荧光显微镜和流式细胞仪评估细胞转染效率,蛋白质印迹法检测Cbl-b蛋白表达情况.转染72 h后,利用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)比较各组细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)分泌水平.转染72 h后,观察对比单纯T细胞、阴性对照T细胞及转染T细胞与小鼠4T1乳腺癌细胞共培养时肿瘤杀伤效率.结果 原代培养T细胞纯度为93.7％.利用UT-MD技术介导shRNA转染效率达到61.3％.qPCR和蛋白质印迹法检测结果显示,Cbl-b基因和蛋白水平表达均能被有效抑制.与空白组(1.007±0.022)相比,实验组Cbl-b mRNA表达量(0.333±0.046)明显降低,P<0.001;实验组、对照组和空白组Cbl-b蛋白相对表达量分别为0.301±0.080、0.773±0.101和0.719±0.090,检验统计量组间总变异,F=38.751,P<0.001;实验组Cbl-b蛋白表达显著降低.与空白组〔(74±6)pg/mL〕相比,实验组T细胞因子TNF-α分泌〔(157±26)pg/mL〕水平明显升高,P=0.001.转染72 h后,与空白组及阴性对照组T细胞相比,在15:1(P=0.046)、30:1(P=0.028)和60:1(P=0.003)的效靶比水平,转染T细胞杀瘤活性均明显增高.结论 利用UTMD技术介导shRNA转染能有效沉默Cbl-b基因表达,促进T细胞免疫活性,增强T细胞对小鼠4T1乳腺癌细胞的体外免疫杀伤效率.
Cbl-b、超声介导微泡破裂技术、基因沉默、乳腺癌、免疫治疗
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R737.9(肿瘤学)
成都市科技惠民基金2015-HM01-00224-SF
2018-07-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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