人TNFα真核表达载体的构建及其在人肝癌耐药细胞株HepG2/ADM中的稳定表达

摘要：

目的:构建可在真核细胞内表达人肿瘤坏死因子alpha (hTNF-α) 基因的真核表达载体,建立稳定表达hTNF-α基因的细胞模型.方法: 应用RT-PCR 的方法从分离的正常人外周血单核细胞(LPS刺激)中,扩增出hTNF-αcDNA ,连接至载体pMD18-T vector中,经酶切鉴定与序列测定证实;以亚克隆法构建于真核表达载体pBK-CMV的相应酶切位点, 转化至大肠埃希菌DH5α,最后将表达的pBK-hTNFα重组蛋白行SDS-PAGE电泳,并作考马斯亮蓝染色分析,Western blot鉴定;经脂质体Lipofectamine2000转染HepG2/ADM细胞后,经G418筛选,通过ELISA、RT-PCR方法检测其在体外转染肝癌耐药细胞HepG2/ADM后hTNFα基因和蛋白的表达.结果:自正常人外周血单核细胞中克隆的hTNF-αcDNA 成功连接到pMD18-T vector,用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切、经序列测定证实,与Genbank的序列完全一致;pBK-hTNFα的克隆表达重组蛋白经Western blot证实此蛋白为hTNFα.克隆基因正确插入载体pBK-CMV中.pBK-hTNFα经脂质体介导转染肝癌耐药细胞后, ELISA、RT-PCR方法检测到其在转染细胞中稳定表达.结论:通过DNA重组技术成功地构建了可在体外稳定表达hTNF-αcDNA 全长的真核表达载体pBK-hTNFα.

关键词：肝肿瘤、肿瘤坏死因子α/遗传学、DNA、重组、基因表达、遗传载体、聚合酶链反应

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分类号：R739.6(肿瘤学)

资助基金：卫生部临床学科重点项目20012434

在线出版日期：2007-04-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：261-264