玉米大斑病菌实时荧光定量PCR内参基因的筛选与应用

摘要：

由异宗配合的子囊菌大斑凸脐蠕孢(Exserohilum turcicum)引起的大斑病(northern leaf blight)是我国玉米(Zea mays)和高粱(Sorghum bicolor)生产的重要真菌病害.为筛选适用于玉米大斑病菌实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR;qRT-PCR)的内参基因,本研究以转录延伸因子1α(elongation factor-1α,EF-1α)、新生多肽相关复合物α多肽(nascent-polypeptide-associated complex alpha polypeptide,NACA)、60S核糖体蛋白L2(60S ribosomal protein L2,RPL2)、60S核糖体蛋白L37a(60S ribosomal protein L37a,RPL37A)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,UBC)、α微管蛋白(α-tubulin,TUBA)、肌动蛋白(actin,ACT)和β微管蛋白(β-tubulin,TUBB)为候选内参基因,以玉米大斑病菌4个不同菌株、3个不同发育阶段、体内侵染4个不同时期以及苯醚甲环唑胁迫4个不同时间的样品为实验材料,通过qRT-PCR技术测定玉米大斑病菌各候选内参基因在上述不同条件下的表达量,利用geNorm(v3.5)、NormFinder(v0.953)、BestKeeper(v1.0)、Delta-CT以及RefFinder(http://blooge.cn/RefFinder/)等分析方法综合评价候选内参基因的表达稳定性.同时,分别以筛选的稳定性较好和较差的内参基因,分析玉米大斑病菌羊毛甾醇14α去甲基化酶(lanosterol 14α-demethylase,CYP51)基因在苯醚甲环唑胁迫下的表达规律.结果表明,8个候选内参基因的扩增效率范围为90.3％～97.8％(r>0.99),熔解曲线峰图均为单一峰,符合qRT-PCR的扩增效率要求.TUBA和TUBB适于做玉米大斑病菌不同菌株间基因表达分析的内参基因;RPL2和TUBA是不同发育阶段表达较稳定的内参基因;NACA和TUBA是体内侵染不同时期较理想的内参基因;ACT适于做苯醚甲环唑胁迫不同时间基因表达分析的内参基因.qRT-PCR分析表明,在苯醚甲环唑胁迫下,玉米大斑病菌CYP51基因的表达量随时间的推移显著增加,胁迫24 h时,表达量达到最大,胁迫36 h表达量显著下调(P<0.05).以稳定性较好的ACT作为内参基因时,与未胁迫组相比,苯醚甲环唑胁迫可显著诱导玉米大斑病菌CYP51基因上调表达(P<0.05).但是,以稳定性较差的TUBB作为内参基因时,得出了2个菌株的CYP51基因表达量相反的结果.本研究为玉米大斑病菌基因表达定量分析提供了有效的校正工具,确保基因定量分析的准确性,为进一步研究玉米大斑病菌抗药基因过表达提供了参考依据.

关键词：大斑凸脐蠕孢、实时荧光定量PCR、内参基因、扩增效率、表达稳定性

所属期刊栏目：31

分类号：S432.1(病虫害及其防治)

资助基金：福建省属公益类科研院所专项;国家重点研发计划;福建省农业科学院协同创新工程;福建省农业科学院协同创新工程;福建省农业科学院农作物重大有害生物灾变机制与绿色防控科技创新团队

在线出版日期：2023-03-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共16页

页码：867-882