基于重组毕赤酵母的鲫鱼c型溶菌酶生物合成及其特性

摘要：

c型溶菌酶是鲫鱼(Carassius auratus)先天性免疫机制中的关键性免疫蛋白,是绿色饲料添加剂或天然抗菌剂开发的良好候选者.本研究通过反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术克隆鲫鱼c型溶菌酶的cDNA,再经3次PCR获得目的基因CrCLm(crucian carp c-type lysozyme mature peptide).以pPICZɑA为表达载体、毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33为工程菌,构建重组菌株X-33/pPICZɑA-CrCLm;在初始pH 6、28℃和250 r/min条件下,以1.0％甲醇诱导重组菌株表达96 h;表达产物经镍离子亲和层析纯化后进行Western blot分析和LC-MS/MS质谱鉴定.另外,对重组菌株产物的抑菌活性和稳定性进行分析,结果显示,在上述发酵培养条件下获得18.3 mg/L重组蛋白,纯化后的质谱分析显示其为重组CrCLm(预期分子量为14.5 kD).抑菌试验显示,重组CrCLm对革兰氏阳性菌—蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(B.subtilisi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)以及革兰氏阴性菌—大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)具有明显的抑菌活性;不同酸性环境和高温处理后并不影响其抑菌活性;此外,重组CrCLm对胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K的水解具有良好的耐受能力.本研究为鲫鱼c型溶菌酶的规模化制备及应用提供技术支持.

关键词：鲫鱼;c型溶菌酶;重组毕赤酵母;抑菌活性;稳定性

所属期刊栏目：29

分类号：S188(农业生物学)

资助基金：国家十三五重点研发计划2016YFD0400106

在线出版日期：2021-11-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共12页

页码：2177-2188