猪Rosa26位点敲入Loxp修饰的hCD55成纤维细胞系的建立

摘要：

人补体调节蛋白(human complement regulatory protein,hCRP)基因,如人类簇分化抗原55(human cluster of differentiation 55,hCD55),在异种器官移植中尤为重要.本研究在α-1,3半乳糖苷转移酶(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)基因敲除(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)巴马小型猪(Susscrofa)耳成纤维细胞的基础上,利用CRISPR/Cas9技术在猪Rosa26 (reverse orientation splice acceptorβ-geo26)基因座敲入hCD55基因,以制备hCD55基因高效表达的细胞系.分别构建靶向切割pRosa26位点intron 1(内含子1)的Cas9表达载体,及pRosa26位点同源重组hCD55的表达载体,后者包含异源Loxp位点间的EF1α(polypeptide chain elongation factor 1 α)启动子调控的hCD55基因、潮霉素B磷酸转移酶基因(hygromycin B phosphotransferase,HPH)、胸腺激酶基因(thymidine kinase,TK)为正负筛选基因.将Cas9-Rosa26表达载体和pEF1α-hCD55表达载体共电转染猪耳成纤维细胞系,培养液中加入丙氧鸟苷(Ganciclovir,GCV)和潮霉素(hygromycin,Hyg)进行筛选,培养至单细胞克隆.通过跨5’端和3’端同源臂的两对引物PCR检测目的基因整合情况,反转录(reverse transcription PCR,RT-PCR)和Western blot检测hCD55在细胞中的表达情况.药物筛选后得到94个克隆点,经PCR鉴定,定点整合hCD55的阳性克隆点2个,定点整合效率为2.1％.RT-PCR结果显示,阳性克隆点细胞表达hCD55基因,Western blot结果进一步证实hCD55在细胞有表达.本研究在GTKO巴马小型猪耳成纤维细胞系基础上成功构建了表达目的基因hCD55的细胞系,为异种移植供体猪的制备提供了基础资料.

关键词：猪、pRosa26、hCD55、CRISPR/Cas9、异种移植、Loxp

所属期刊栏目：26

分类号：S813.3;Q812(普通畜牧学)

资助基金：国家重点研发计划项目2017YFC1103702

在线出版日期：2018-08-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：1074-1083