血管内皮特异性表达人血栓调节蛋白转基因猪的研究

摘要：

生理条件下,血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)可与凝血酶结合成复合物,该复合物既可通过激活蛋白C达到抗凝和促纤溶作用;又可经内皮细胞胞吞,通过细胞内溶酶体降解、清除体内凝血酶.另外,TM可与凝血因子Xa特异性结合,抑制凝血酶原的活化,进而使凝血酶的生成速率明显降低.移植后,猪(Sus scrofa)的血管暴露在人(Homo sapiens)血液中,猪TM无法与人的凝血酶发生结合从而使凝血功能紊乱,因此,在猪体内表达人TM是目前解决凝血功能异常的一个新的思路.本研究制备了血管内皮特异性表达人血栓调节蛋白(human thrombomodulin,hTM)的转基因克隆猪,研究了hTM在五指山小型猪血管内皮细胞表达情况.利用Red重组系统从细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)上抓捕获得猪的内源TM启动子.PCR扩增获得hTM的cDNA及牛生长素PolyA(bGHpA)序列,依次酶切连入pBlueScriptⅡSK(-),构建血管内皮特异性表达hTM的载体.获得的载体pBS-h TM-puro经Xho Ⅰ线性化,电转染五指山小型猪胎儿成纤维细胞,经1.0 μg/mL嘌呤霉素筛选10～15 d得到339个转hTM基因的阳性克隆,取两个生长较好的克隆用于核移植,随后获得重构胚972枚.胚胎移植后产仔猪5头;其中4头经基因组DNA、组织RT-PCR检验为阳性,Western blot结果显示hTM为血管内皮细胞特异性表达.成功获得可特异性表达hTM转基因细胞系及转基因克隆猪,为解决异种器官移植后出现的凝血紊乱问题提供了资料基础.

关键词：异种移植、血栓调节蛋白、特异性表达、五指山小型猪

所属期刊栏目：26

分类号：S188;Q812(农业生物学)

资助基金：国家重点基础研究发展计划2011CBA01004;河南省科技研发合作项目和河南大学研究生综合教育改革项目Y1317006

在线出版日期：2018-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：556-563