ITGA5慢病毒shRNA表达载体及Bel-7404稳定细胞系的构建

摘要：

目的 构建整合素α5基因(ITGA5)的短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达载体,并建立稳定沉默ITGA5表达的肝癌细胞系Bel-7404.方法 设计3条ITGA5基因特异性shRNA靶序列和1条非特异性序列作为阴性对照(NC),分别克隆到GV493质粒载体中,转化感受态细胞后挑取阳性克隆子进行DNA测序鉴定,包装成重组慢病毒,并纯化、测定病毒滴度.将4组慢病毒载体分别感染人肝癌细胞Bel-7404,使用嘌呤霉素筛选后,在荧光显微镜下观察GFP的表达,qPCR和Western blot分别检测各组中ITGA5的基因和蛋白质表达水平.结果 ITGA5基因shRNA慢病毒表达载体经过测序鉴定构建成功,qPCR和Western blot检测结果显示3种慢病毒干扰组的ITGA5表达水平均低于NC组(P均<0.05).NC组mRNA的表达量为(100±2.3)％,ITGA5-shRNA-1、ITGA5-shRNA-2、ITGA5-shRNA-3组mRNA相对表达量分别为(10.7±3.7)％、(16.7±1.5)％、(11.8±2.9)％,且其干扰效率均达到70％以上,可选择其中一个干扰靶点进行后续实验.结论 成功构建ITGA5基因shRNA慢病毒表达载体,感染肝癌Bel-7404细胞并成功筛选出稳定沉默细胞系,为进一步研究ITGA5在肝癌中的生物学功能和作用机制提供了实验基础.

关键词：整合素α5基因、短发卡shRNA、慢病毒表达载体、肝癌

所属期刊栏目：40

分类号：R735.7(肿瘤学)

资助基金：宁夏医科大学优势学科群建设项目2001060703

在线出版日期：2018-09-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：249-253,260