10.12302/j.issn.1000-2006.202204012
CRISPR/Cas9 核糖核蛋白介导的无T-DNA插入的白桦BpGLK1精准突变
[目的]CRISPR/Cas9 RNP系统是一种高效的基因编辑技术,具有简单、精准等特点,已被广泛应用于动、植物的基因编辑研究中.目前,通过微粒轰击技术将Cas9 蛋白和gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)导入受体细胞,获得无选择标记的基因编辑植物,该技术的提出为快速创制植物突变体提供了崭新思路.[方法]本研究以白桦(Betula platyphylla×B.pendula)BpGLK 1基因为编辑的靶基因,采用CRISPR/Cas9 RNP技术开展无T-DNA插入的BpGLK 1基因编辑.在白桦BpGLK 1基因的第 1 外显子处设计靶位点,采用PCR扩增技术获得BpGLK 1-E1 靶位点片段;采用酶切及连接技术构建pAbAi-BpGLK 1-E1 重组质粒,将该质粒线性化后与Cas9 蛋白作用,体外检测CRISPR/Cas9 RNP活性及gRNA的精准性.以白桦合子胚诱导的愈伤组织为受体,采用微粒轰击技术进行BpGLK 1定向诱变.[结果]CRISPR/Cas9 RNP体外活性检测显示:Cas9 蛋白及gRNA复合体具有裂解活性,可在BpGLK 1靶位点的特定位点进行有效切割.以白桦成熟胚为材料,在无光照条件下培养 25d左右可获得幼嫩愈伤组织,以其为受体在轰击距离为 12 cm、7 584.5 kPa条件下,用包被Cas9 蛋白与gRNA(RNP)金粒进行轰击,随后经过分化培养及继代培养可获得叶色呈现黄绿色的glkc突变株,测序结果显示,该突变株的BpGLK 1基因产生 18 bp的纯合缺失突变.[结论]利用CRISPR/Cas9 编辑技术可实现无T-DNA插入的白桦BpGLK 1精准突变.
CRISPR/Cas9 系统、无T-DNA插入、基因编辑、白桦
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Q789;S722(基因工程（遗传工程）)
国家重点研发计划2021YFD2200103
2024-01-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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