罗非鱼湖病毒微滴式逆转录数字PCR检测方法的建立

摘要：

建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的罗非鱼湖病毒反转录微滴式数字PCR(RT-ddPCR)检测方法,可为罗非鱼湖病毒的定量检测提供技术支持.参照NCBI中GenBank登陆的TiLV第3段全基因序列,选择hypothetical protein gene基因作为靶位基因设计合成了 1对引物和探针,以TiLV-cDNA为模板,摸索、优化反应方法,建立与实时荧光RT-PCR检测方法的线性关系,分析方法的敏感性、特异性、重复性,最后进行临床样品检测.结果显示,当引物、探针浓度分别为500、300 nmol·L-1且退火温度为54.2℃时,建立的TiLVRT-ddPCR扩增反应效率最高、阴阳性微滴分布界限最明显、平均拷贝数较高;敏感性强,检测限低至2拷贝·μL-1,且在1～90 000拷贝·μL-1范围内与实时荧光RT-PCR检测的线性关系较好(R2=0.995 8);检测变异系数低(4.86％);与其他5种常见的水生动物疫病病毒[鲤浮肿病毒(Carp edema virus,CEV)、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)、草鱼出血病毒(Grass carp reovirus,GCRV)、鲫造血器官坏死病毒(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)、细胞肿大虹彩病毒(Red sea bream iridovirus,RSIV)]阳性样品未发生交叉反应;在临床样品的检测中,48份罗非鱼样品结果均为阴性,5份能力验证样品中3份为阳性,与能力验证满意结果一致.

关键词：罗非鱼湖病毒、微滴式逆转录数字PCR、线性关系、特异性、变异系数

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分类号：S943(水产保护学)

资助基金：东莞市省乡村振兴战略专项资金大专项+任务清单项目20211800400112

在线出版日期：2023-04-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：75-85