GLS 3’-非编码区-荧光素酶报告质粒的构建及其活性鉴定

摘要：

目的 构建颗粒溶素基因3’-非编码区(3’-untranslated region,3’-UTR)-荧光素酶报告质粒,检测颗粒溶素和微小RNA(miRNA)调控位点的关联性.方法 将人工合成的GLS基因3’-UTR区序列,克隆至荧光素酶报告质粒pGL3-control;通过Targetscan5.1等软件预测可能与GLS基因3'-UTR作用的miRNA；将荧光素酶报告质粒和miRNA真核表达质粒共转染293T细胞,为防止脱靶效应,同时转染anti-mir-inhibitor和anti-mir-control,用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性.结果 用Targetscan5.1软件、PicTar软件和miRBase数据库预测交叉结果显示,miRNA(mir)-218 、mir-514 、mir-185 、mir-611均与GLS基因3'-UTR存在互补结合位点；构建的miRNA真核表达质粒和荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确；2种质粒共转染293T细胞后,miRNA-218可使荧光素酶报告质粒表达的荧光素酶活性降低75％左右(P＜0.01)；转染anti-mir-inhibitor后,荧光素酶的表达恢复到正常水平.结论 成功构建了GLS基因3’-UTR荧光素酶报告质粒,通过检测荧光素酶活性,筛选出和GLS表达相关的miRNA片段即miRNA-218,为探讨miRNA调控GLS表达机制打下实验基础.

关键词：GLS、miRNA、3’-非编码区、荧光素酶报告质粒

所属期刊栏目：29

分类号：R392.12

资助基金：国家青年科学基金81101216

在线出版日期：2013-03-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：33-37