10.13275/j.cnki.lykxyj.2019.01.006
红豆杉TbAP2基因荧光定量PCR体系的建立及优化
[目的]建立稳定可靠的、适合检测红豆杉(Taxus L.)TbAP2基因表达量的荧光定量PCR实验体系.对于检测该物种中基因的组织特异性表达具有重要意义.[方法]以曼地亚红豆杉细胞为试材,提取总RNA并反转录为cDNA,根据TbAP2基因序列设计多对引物,合成内参基因TBC41的引物,采用正交试验L9(34)方法分别筛选以上2个基因5μL和10μL小反应体系及20μL常用体系中的最佳组合,并通过cDNA模板用量和引物用量等方面进行优化,以确保基因扩增效率在90％105％之间.[结果]本研究建立了TBC41和TbAP2基因在5、10、20μL体系下的荧光定量最佳PCR反应体系,在优化后的5μL体系下,加入Mix(2×)Universal 2.5μL,cD-NA模板1.0μL,正反引物共1.5μL,内参基因TBC41和目的基因TbAP2的扩增效率均为94％;在优化后的10μL下,加入Mix(2×)Universal 5μL,cDNA模板1.2μL,正反引物共1.3μL,TBC41和TbAP2的扩增效率分别为95％和94％.在优化后的20μL下,加入Mix(2×)Universal 10μL,cDNA模板0.5μL,正反引物共1.5μL,TBC41和TbAP2的扩增效率分别为93％和99％,以上各扩增体系回归系数R2均大于0.980.[结论]在以上3种反应体系下,内参基因和目的基因均具有接近100％的扩增效率,表明本研究成功建立了适合检测红豆杉TbAP2基因表达量的荧光定量PCR实验体系,并为红豆杉其它基因的表达研究提供参考.
红豆杉、AP2、正交试验、实时荧光定量PCR
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S718.46(林业基础科学)
国家自然科学基金项目31570675、31670676;中国林业科学研究院基本科研业务费专项资金CAFYBB2014QB001
2019-04-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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