偏肿革裥菌锰过氧化物酶的分级纯化
[目的]研究白腐菌偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)锰过氧化物酶(MnP)的分级纯化,以期得到 L.gibbosa MnP的纯品和进行后续酶学性质研究.[方法]在对 L. gibbosa所产 MnPs进行优化培养、获得大量 MnPs 粗酶液的基础上,通过硫酸铵(NH4)2SO4分级盐析、聚乙二醇(PEG)沉淀进行粗酶液浓缩、在起始缓冲液中进行透析、经DEAE-琼脂糖 CL-6B离子交换柱层析进行梯度洗脱和葡聚糖 G-75凝胶过滤柱层析等方法对 MnPs粗酶液进行纯化,并对分级纯化方法进行优化,对纯化浓缩后的纯酶样品采用 SDS-PAGE 方法进行酶纯度检验.[结果]在75%、80%和85%这3种(NH4)2SO4饱和度中,85%的(NH4)2SO4是沉淀 MnPs的适宜饱和度,在该饱和度下测得上清液中酶活为3.63 U·L -1,蛋白浓度为0.132 mg·mL -1,表明 MnPs已基本沉淀完全;试管小试法确定离子交换柱层析中上样的最适缓冲体系为pH7的 Na2HPO4-NaH2PO4起始缓冲液;离子交换柱层析后收集的洗脱液检测到3个蛋白吸收峰,其中只在第2个蛋白吸收峰中检测出 MnP活性,该 MnP活性值变化曲线与蛋白吸光值一致.这个活性峰经凝胶过滤柱层析后,洗脱结果只出现1个明显的蛋白吸收峰,在其中检测出较高的 MnP 活性;浓缩后的冻干样品经 SDS-PAGE电泳检测只在约40 kDa处有1条清晰的蛋白谱带,表明对 MnP的纯化已达到电泳纯.[结论]筛选出85%饱和度的(NH4)2SO4盐析法是初期沉淀与纯化 L. gibbosa所产 MnPs的最适方法;PEG 浓缩法简便、易行、有效;初期浓缩后再经过离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析可以得到电泳纯的 MnP纯化样品.
偏肿革裥菌、锰过氧化物酶、纯化、离子交换柱层析、电泳纯
53
S718.81(林业基础科学)
东北林业大学博士研究生自主创新基金项目2572016AA04;黑龙江省自然科学基金项目C2016006
2017-11-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共7页
64-70
