刚毛柽柳ThP5 CR基因的克隆及抗逆功能分析
[目的]脯氨酸在植物对盐和干旱胁迫应答中起重要的渗透调节作用,增加植物体内脯氨酸含量可以提高植物抗逆性.吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)是合成脯氨酸的重要还原酶,本研究拟从抗旱耐盐植物刚毛柽柳中克隆获得1个ThP5CR基因,研究该基因的抗逆功能,为该基因用于林木基因工程育种奠定理论基础.[方法]以"Pyrroline 5 Carboxylate Reductase"作为关键词,对实验室前期构建的刚毛柽柳转录组序列进行比对查找获得ThP5CR基因cDNA序列,并通过RT-PCR和测序验证克隆获得的ThP5CR基因序列.利用生物信息学工具进行序列分析.利用Real time RT-PCR分析不同逆境处理下ThP5CR基因在刚毛柽柳根和叶中的表达情况.为了进一步分析ThP5CR基因的抗逆功能,构建了植物过表达载体pROKⅡ-ThP5CR,并进行刚毛柽柳瞬时转化,同时以pROKⅡ瞬时侵染刚毛柽柳作为对照.分析比较NaCl和甘露醇胁迫后2种瞬时转化刚毛柽柳的脯氨酸、MDA、H2O2含量和二氨基联苯胺(DAB)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)及伊文思蓝(Evans blue)染色情况,以综合评定ThP5CR基因的抗逆功能.[结果]ThP5CR基因编码273个氨基酸,编码蛋白分子量为28.29 kDa,理论等电点为9.22.含有典型的NADP结构域和P5CR二聚体结构域.2种胁迫(NaCl和PEG6000)和3种激素(ABA、GA3和JA)处理后,刚毛柽柳ThP5CR基因的表达都发生了不同程度的改变,且每种处理后至少有1个时间点发生了明显改变.此外,NaCl胁迫、PEG6000胁迫和ABA激素处理对ThP5CR基因的表达产生的影响更为显著.对2种瞬时表达刚毛柽柳植株中ThP5CR基因的表达分析显示成功获得瞬时过表达转基因株系(标记为OX).进一步的生理指标和生理染色结果显示,非胁迫条件下,过表达植株脯氨酸含量高于对照植株(标记为Con);150 mmol·L-1 NaCl和200 mmol·L-1甘露醇胁迫后,2种转基因株系脯氨酸含量差异则更显著;NBT、DAB染色和H2 O2含量测定结果显示,OX植株的O-·2和H2 O2含量明显低于对照;而Evans blue染色结果和MDA含量测定表明,与对照相比,过表达ThP5CR植株着色更浅、MDA含量更低.[结论]ThP5CR基因能对NaCl、PEG胁迫和ABA等激素处理做出应答,可能参与了刚毛柽柳抗旱耐盐胁迫应答.在150 mmol·L-1 NaCl和200 mmol·L-1甘露醇胁迫下瞬时过表达ThP5CR植株可通过增加脯氨酸含量增强细胞内清除活性氧能力,使O-·2和H2 O2的积累减少,从而减少细胞受损或细胞死亡,增强植物的抗逆性.本研究初步证实ThP5CR基因是一个逆境胁迫应答候选基因.
吡咯啉-5-羧酸还原酶、刚毛柽柳、基因表达、耐盐、抗旱
53
S718.46(林业基础科学)
国家高技术研究发展计划863 计划2013AA102701
2017-09-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共9页
1-9
