人Orai1基因真核表达载体的构建及在足细胞中的表达

摘要：

目的 构建重组人Orai1基因真核表达载体,观察其在小鼠肾小球足细胞株(MPC5)中的表达.方法 根据GcnBank数据库检索到的人Orai1基因序列,人工合成法合成Orai1基因编码区(coding scqucnce,CDS)全长序列,克隆至质粒表达载体PG-CMV-IRES-EGFP,构建重组质粒载体PG-CMV-Orai1,通过PCR、双酶切及基因测序等方法进行鉴定;以脂质体转染法将重组质粒转染至MPC5细胞,应用荧光显微镜观察绿色荧光检测转染效率,RT-PCR、Wcstcrn blot法分别检测Orai1 基因的转录与翻译.结果 PCR扩增的片段长度为906 bp,双酶切出现两条带,其中约906 bp处可见目的条带.核酸测序结果与GcnBank中所报道的人Orai1基因的CDS序列完全一致.转染后48h置荧光显微镜下观察,85％以上的足细胞中可见绿色荧光.RT-PCR及Wcstcrn blot实验结果分别显示转染后的MPC5细胞在mRNA与蛋白水平表达Orai1均有所增强.结论 成功构建了重组人Orai1基因真核表达载体PG-CMV-Orai1,并建立了过表达Orail基因的肾小球足细胞模型,为深入研究钙库操纵的Ca2+通道与足细胞病之间的关系奠定了良好的实验基础.

关键词：足细胞、基因、真核表达

所属期刊栏目：14

分类号：R65;R73

资助基金：连云港市科技局社会发展计划SII1117;连云港市第一人民医院青年英才基金QN121001

在线出版日期：2014-08-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：369-373