雷帕霉素对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬诱导效应及其分子机制的初步研究

摘要：

目的:初步探讨雷帕霉素在不同浓度和不同孵育时间下,对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的诱导效应及其分子机制.方法:不同浓度雷帕霉素处理HaCaT细胞4h或12h后,利用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法检测雷帕霉素对细胞活力的影响,并提取蛋白进行蛋白印迹实验,检测LC3-Ⅱ表达水平,作为自噬的检测方法;通过透射电镜分析自噬体形成,确认雷帕霉素对自噬的诱导效果.检测自噬调控上游关键元件哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白表达及其ser2481和ser2448磷酸化产物水平,分析mTOR活性;并分析自噬调控下游的另一关键基因Atg7的表达,初步分析雷帕霉素诱导HaCaT细胞的分子机制.结果:不同浓度雷帕霉素处理4h,对HaCaT细胞的活力没有显著的影响.高剂量雷帕霉素(80 nmol/L和100 nmol/L)在处理12h后对HaCaT细胞的活力产生毒性效应.20 nmol/L和50 nmol/L雷帕霉素孵育4h诱导HaCaT细胞LC3-Ⅱ表达上调,而20 nmol/L和50 nmol/L雷帕霉素孵育12h仍具有诱导效应.相较于其他浓度,在50 nmol/L雷帕霉素孵育诱导的LC3-Ⅱ表达上调效应最为显著,并且在药物孵育4h时超微结构水平诱导产生胞质内大量自噬体形成.1～50 nmol/L浓度的雷帕霉素孵育4h或12h均可诱导HaCaT细胞mTOR ser2481和mTOR ser44s磷酸化产物水平降低;然而Atg7表达不能观测到显著的差异.结论:50 nmol/L雷帕霉素孵育4h具有显著的诱导HaCaT细胞自噬效应.HaCaT细胞mTOR分子对雷帕霉素处理敏感,可被其诱导产生蛋白活化抑制效应.这种mTOR信号抑制可能参与了雷帕霉素对HaCaT细胞的自噬诱导效应,但Atg7没有参与这种调控效应.

关键词：雷帕霉素、角质形成细胞、自噬

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分类号：R751(皮肤病学与性病学)

资助基金：国家自然科学基金面上项目81371755、81171513;江苏省基础研究计划自然科学基金面上项目BK20131064;高等学校博士学科点专项科研基金20111106110041、20131106120046;2013年度北京协和医学院协和青年科研基金3332013058

在线出版日期：2014-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：267-271