产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)钼铁蛋白α-423Ile位点的突变导致固氮酶催化活性降低

摘要：

基于前期对固氮酶催化过程中存在两条电子传递通路的推论,探索从与P原子簇共价相连的β-93Cys出发至FeMoco之间重要的氨基酸位点.通过分析固氮酶钼铁蛋白的结构,利用体外定点突变和基因替代技术,将产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)固氮酶β-102Asn,α-431Lys和α-423Ile位点分别替换为β-102Ala,α-431His和α-423Pro,获得Nβ102A,Kα431H和Iα423P突变株.3个突变对细菌固氮生长有不同程度的影响,其中Iα423P突变株几乎无固氮生长,细胞乙炔还原活性显著下降;在42L发酵罐中培养,其细胞最高固氮酶活性仅为野生型菌株的1/6; qRT-PCR检测发现此突变株nifD基因4倍的上调表达.分离纯化Iα423P钼铁蛋白,其最高C2H2和H+还原水平分别为野生型的13％和21％.根据以上研究结果推论,突变固氮酶的催化活性显著降低,或与直接打破α-423Ile与高柠檬酸长臂之间的氢键有关,推测α-423Ile是固氮酶催化底物还原过程中,电子经高柠檬酸长臂进入活性中心Mo位的入口氨基酸.

关键词：产酸克雷伯氏杆菌、固氮酶、催化机制、定点突变、质子/电子传递途径

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在线出版日期：2014-06-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：1215-1222