肺炎克氏杆菌固氮酶双突变株的构建及其对底物还原的特性

摘要：

通过定点突变及基因替代技术,将肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae,Kp)野生型菌株的固氮酶钼铁蛋白α亚基中铁钼辅因子(FeMoco)周围多肽链的Glnα190和Hisα194分别置换为Lys和Gln,并构建成2个单突变株,命名为Kp-Qα190K和Kp-Hα194Q.将上述2个突变分别引入Kp-nifV突变株(与FeMoco相连接的高柠檬酸被柠檬酸置换)获得另外2个双突变株,命名为Kp-Qα190K-nifV-和Kp-Hα194Q-nifV-.对上述4种突变株进行诱导培养和细胞的固氮酶活性分析表明,4种突变株都失去了固氮活性,乙炔(C2H2)还原活性也大幅度降低,Kp-Qα190K单突变株的乙炔还原活性比Kp-Hα194Q单突变株下降得多;Kp-Qα190K-nifV-双突变株几乎完全丧失了活性,而Kp-Hα194Q-nifV-双突变仍保留野生型菌株10%的乙炔还原活性.突变株将氘代乙炔(C2D2)还原成氘代乙烯(C2D2H2)的情况是:Kp-Qα190K和Kp-Hα194Q-nifV-突变株的C2D2还原产物中,反式-1,2-二氘代乙烯比例比Kp野生型增加了1倍,表明固氮酶催化加氢的立体构型选择性降低.以上结果表明,固氮酶活性中心周围多肽环境中Gln α190残基,及与FeMoco相连的高柠檬酸,可能直接参与质子和/或电子向活性中心FeMoco的传递.推测Gln α190和与FeMoco的Mo原子相连的高柠檬酸,在质子和/或电子通过Mo位进入FeMoco起关键作用.这种双突变株所产生的固氮酶,有利于在体外研究固氮酶的催化机制,可以通过分析用于还原底物的电子和质子进入活性中心FeMoco的位点,推测出底物在活性中心中的络合和还原的部位.

关键词：Klebsiella pneumoniae、双突变株、固氮酶活性、底物还原

所属期刊栏目：49

分类号：R5(内科学)

资助基金：国家重点基础研究发展计划973计划001CB108904;国家自然科学基金30270019

在线出版日期：2004-09-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：1512-1518