大鼠骨桥蛋白干扰质粒的构建及其干扰效率的鉴定

摘要：

目的:构建针对大鼠骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因的小干扰RNA(microRNA,miRNA)绿色荧光蛋白表达载体,并转染大鼠原代皮肤成纤维细胞后,通过半定量RT-PCR法对其干扰效率进行鉴定,从而筛选出最佳的干扰序列.方法:体外化学合成大鼠OPN序列特异性pre-miRNA双链(OPNi-1,OPNi-2及OPNi-3)和非特异性对照双链OPNi-3M,并分别将退火后的双链克隆至线性质粒表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR.经测序验证后,脂质体介导转染293T细胞进行真核表达验证,并进一步将4种重组质粒经脂质体介导转染大鼠原代皮肤成纤维细胞,半定量RT-PCR法检测各个重组质村对OPN的干扰效果.结果:经测序验证并转染293T细胞后证明4种重组质粒均构建成功.进一步转染大鼠原代皮肤成纤维细胞后,半定量RT-PCR结果显示OPNi-1、OPNi-2、OPNi-3和OPNi-3M对OPN抑制率分别为49%、35%、21%和2%,而各组间β-actin表达无显著性差异.结论:成功构建针对大鼠OPN的miRNA真核表达载体,其中OPNi-1对大鼠原代成纤维细胞OPN的表达具有最佳抑制率,而对照组OPNi-3M几乎无干扰效果.

关键词：骨桥蛋白、小干扰RNA、干扰质粒、鼠

所属期刊栏目：19

分类号：R782;Q782(口腔科学)

资助基金：国家自然科学基金面上项目30872904;2008年教育部博士点基金项目200802470023

在线出版日期：2010-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：385-389