家蚕β-呋喃果糖苷酶基因BmSuc1的CRISPR敲除载体的构建与导入

摘要：

[目的]CRISPR/Cas9是近些年报道较多的基因编辑新工具,具有简便高效、特异性强等优势.BmSuc1是从鳞翅目经济昆虫家蚕Bombyx mori体内发现的编码β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase,β-FFase)的基因,也是首个被克隆和鉴定的动物型β-FFase编码基因.β-FFase是作用于果糖基的蔗糖水解酶,BmSUC1可能与家蚕防御桑叶生物碱的生理过程有关,但目前其发挥作用的分子机制尚不清晰.为了解析BmSuc1在蚕体的作用途径及其生理功能,本研究基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建表达双元sgRNA的CRISPR载体,用于敲除家蚕基因组中的BmSuc1基因.[方法]根据目的基因BmSuc1的ORF序列设计2条sgRNA,通过同源重组的方法分别插入CRISPR载体的SalⅠ和Nhe Ⅰ酶切位点.进而利用转基因显微注射技术将该编辑载体注入Go代蚕卵,经催青孵化饲养家蚕并自交制备G1代蚕种.[结果]PCR验证及测序结果均表明CRISPR编辑载体构建成功.根据DsRed2红色蛋白的荧光标记,从G1代家蚕幼虫中成功筛选出阳性转基因个体.[结论]本文详细介绍了表达双元sgRNA的CRISPR载体的构建方法,所获得的阳性转基因家蚕对于下一步探讨BmSuc1在家蚕糖类营养的吸收与利用途径中的作用奠定了重要的实验基础,有助于阐明蚕-桑相互选择和适应的分子机制.

关键词：CRISPR/Cas9、基因编辑、sgRNA、家蚕、β-呋喃果糖苷酶

所属期刊栏目：55

分类号：S881.2;Q943.2;Q78

资助基金：国家自然科学基金;创新训练项目;安徽省国际科技合作项目

在线出版日期：2018-08-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：208-216