苜蓿夜蛾葡萄糖氧化酶cDNA的克隆、表达及特性研究

摘要：

【目的】从苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca体内克隆葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOX）基因cDNA序列，并进行原核表达及活性测定。同时对GOX在不同组织的特异表达及对葡萄糖诱导反应的特性进行研究。【方法】以苜蓿夜蛾为材料提取总RNA，利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术，扩增苜蓿夜蛾GOX基因全长cDNA序列。利用原核表达载体pET-21b在大肠杆菌中表达苜蓿夜蛾的GOX基因，并用 Ni-NTA 亲和层析柱将带 His-tag 的目的蛋白进行纯化，再利用梯度透析法进行复性，以葡萄糖为底物进行酶的活性测定。同时利用Real-time PCR分析GOX的组织特异性表达和对葡萄糖的诱导反应。【结果】该cDNA序列有2154个碱基，开放阅读框1824个碱基，编码607个氨基酸组成的多肽，分子量为67.04 ku，多肽的等电点为5.13。该序列命名为HvGOX，在GenBank的登录号为KT907054。序列分析表明，HvGOX 的氨基酸序列与其他昆虫的 GOX 氨基酸序列高度同源。该基因在大肠杆菌表达系统中成功地进行了诱导表达，表达出与预测的蛋白分子量相符的融合蛋白。由原核表达载体表达后的蛋白经过变性、纯化和复性后有活性。Real-time PCR 结果表明，该基因在苜蓿夜蛾的不同组织均有mRNA水平的特异表达，其中在唾腺中的表达量最高；同时用0.01%、0.1%、1%和10%葡萄糖溶液浸泡的大豆叶喂食的幼虫，幼虫体内的GOX的表达均被诱导，且在10%的浓度时诱导表达量最高。【结论】本研究在苜蓿夜蛾体内获得一个新的葡萄糖氧化酶基因，该结果为进一步研究葡萄糖氧化酶在昆虫体内的生物功能奠定基础。

关键词：苜蓿夜蛾、葡萄糖氧化酶、克隆、表达、酶活性

所属期刊栏目：53

分类号：S43;S48

资助基金：Supported projects国家自然科学基金项目31201548；山西省自然科学基金项目2013011028-3

在线出版日期：2016-08-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：696-705