家蚕C类清道夫受体BmSR-C的基因克隆、原核表达及亚细胞定位
[目的]本研究旨在克隆与鉴定家蚕Bombyx mori C类清道夫受体基因BmSR-C,为探析其在家蚕免疫中的功能奠定基础.[方法]利用RACE技术克隆家蚕C类清道夫受体基因全长序列,并对其进行生物信息学分析.利用RT-PCR和qPCR方法对BmSR-C基因的时空表达情况进行检测.通过原核表达和Ni+亲和层析的方法获得BmSR-C重组蛋白,免疫昆明小鼠制备抗BmSR-C多克隆抗体.利用ELISA法和Western blot分别对鼠抗BmSR-C蛋白多克隆抗体的效价和特异性进行检测.构建家蚕BmSR-C的真核表达载体,转染家蚕BmE细胞,分析该蛋白的亚细胞定位情况.[结果]克隆获得家蚕BmSR-C基因(GenBank登录号:BGIBMGA004577),其开放阅读框(ORF)全长为1 821 bp,编码606个氨基酸残基.BmSR-C具有典型的C类清道夫受体家族结构特征,主要由CCP,MAM和SO结构域以及靠近C端的单次跨膜结构域组成.进化分析结果显示鳞翅目昆虫SR-C单独聚为一支,家蚕BmSR-C与同为鳞翅目昆虫的草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda和大红斑蝶Danaus plexippus的同源蛋白亲缘关系最为接近.对BmSR-C基因的时空表达分析表明,BmSR-C在家蚕的马氏管和血细胞中高表达,而在其他组织中无明显表达;其在家蚕不同发育时期的血细胞中均有表达,且在4龄眠期的表达量达到峰值.ELISA检测结果显示,所制得抗体效价高达1∶128 000;Western blot检测结果显示,该抗体可以特异性识别重组蛋白.家蚕BmE细胞中的亚细胞定位结果表明BmSR-C主要定位于细胞膜.[结论]获得家蚕C类清道夫受体基因BmSR-C的完整cDNA序列及其表达特征;成功制备了BmSR-C的多克隆抗体,利用家蚕BmE细胞在细胞水平上分析了BmSR-C的亚细胞定位情况,推测其参与家蚕的生长发育及病原微生物入侵的免疫反应,为进一步研究BmSR-C的生物学功能奠定了基础.
家蚕、BmSR-C、表达分析、原核表达、亚细胞定位
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Q966(昆虫学)
国家自然科学基金项目31672496,31802142;中国博士后科学基金2017M620408;重庆自然科学基金项目cstc2016jcyjA0425;重庆高校创新团队建设计划CXTDX201601010
2018-12-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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