利用酵母双杂交系统筛选本氏烟中与RGSV P5互作的蛋白

摘要：

[目的]水稻草状矮化病是由水稻草状矮化病毒引起的,给粮食产量造成了严重威胁.RGSV P5是该病毒的沉默抑制子,在抵抗寄主RNA沉默中发挥重要作用.筛选、鉴定与水稻草状矮缩病毒(RGSV)沉默抑制子P5互作的寄主蛋白,为揭示水稻草状矮化病毒致病的分子机制提供理论基础,为该病毒病的防治提供有效策略.[方法]利用酵母双杂交技术筛选与水稻草状矮化病毒P5互作的寄主蛋白.提取感染水稻草状矮化病毒的水稻叶片的总RNA.依据P5基因的CDS序列设计特异性引物.利用RT-PCR技术获得P5基因,将P5基因构建到酵母诱饵表达载体pGBKT7上,利用双酶切鉴定诱饵质粒.将诱饵载体pGBKT7、pGBKT7-P5、重组质粒pGBKT7-P5/pGADT7分别转化到酵母感受态细胞Y2H Gold中,通过观察其在缺陷培养基SD/-Trp、SD/-Leu-Trp/上的生长情况及在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上的显色情况检测诱饵质粒的毒性和自激活活性.将烟草酵母cDNA文库质粒转化到含诱饵载体pGBKT7-P5的酵母感受态细胞中,先后用不同缺陷型培养基SD/-Leu/-Trp、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal筛选后获得阳性克隆.经酵母质粒提取、转化、测序和Blast等分子生物学方法最终获得互作蛋白的序列.[结果]RT-PCR扩增得到P5基因,其大小为576 bp.成功构建诱饵载体pGBKT7-P5.表达的诱饵蛋白P5对酵母菌没有毒性和自激活活性.诱饵蛋白P5从本氏烟酵母cDNA文库中进行大量筛选,获得15个阳性克隆,分析后最终得到7个与P5互作的本氏烟蛋白.经生物信息学分析它们分别为线粒体孔蛋白VDAC、ADP核糖基化因子GTP水解酶激活蛋白ArfGAP、囊泡突触结合蛋白Syt-2、延伸因子eEF1A、脯氨酸合成酶共转录的细菌同源蛋白PROSC、非特征蛋白C9orf78及一种未知蛋白.[结论]本研究成功筛选到7个与水稻草状矮化病毒P5互作的寄主因子.这些互作的寄主因子主要参与转运、生物或非生物胁迫、胁迫应答等生物学过程.深入研究这些互作因子将为解析寄主蛋白参与调控病毒的复制、运动、致病等分子机制提供理论基础,为水稻草状矮化病毒病的防治提供新的思路.

关键词：水稻草状矮化病毒、P5蛋白、酵母双杂交、蛋白互作

所属期刊栏目：45

分类号：S435.111.4+9;S432.1(病虫害及其防治)

资助基金：国家自然科学基金;国家自然科学基金;江西省自然科学基金;江西省教育厅基金

在线出版日期：2023-05-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：404-412