利用CRISPR/Cas9系统建立长链非编码RNA SNHG1基因敲除细胞系并研究其功能

摘要：

目的 利用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复机制构建长链非编码RNA(lncRNA)核仁小分子RNA宿主基因1(SNHG1)稳定敲除的A549细胞系,并进行功能研究.方法 设计靶向SNHG1基因的小向导RNA(sgRNA),将其克隆到LentiCRISPR v2质粒中,构建Cas9-sgSNHG1质粒.以A549细胞基因组DNA为模板,PCR扩增5'同源臂(5'Arm)和3'同源臂(3'Arm)序列,以pEGFP-Blast质粒为模板,PCR扩增pEGFP-Blast-polyA序列;利用重叠PCR将3个序列连接为5'Arm-pEGFP-Blast-polyA-3'Arm,通过Gibson克隆将其连接到pUC18质粒上,构建SNHG1同源重组模板质粒.将构建成功的两个重组质粒共转染A549细胞,用杀稻瘟菌素(Blast)筛选稳定插入pEGFP-Blast-polyA的细胞株,挑取单克隆.实时荧光定量PCR(qPCR)检测敲除效率,CCK-8法和克隆形成实验检测细胞增殖活力及克隆形成能力.结果 成功构建Cas9-sgSNHG1及SNHG1同源重组模板质粒,筛选获得敲除效率较高的A549细胞系,发现敲除SNHG1可抑制A549细胞增殖活力及克隆形成能力.结论 SNHG1稳定敲除的A549细胞系构建成功,SNHG1的癌基因功能受到显著抑制.CRISPR/Cas9介导的同源定向修复可有效抑制长链非编码RNA的表达,是长链非编码RNA功能研究的重要工具.

关键词：核仁小分子RNA宿主基因1、长链非编码RNA、CRISPR/Cas9、基因敲除、细胞增殖

所属期刊栏目：47

分类号：Q78;Q753(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家重点研发计划2022YFC3600502

在线出版日期：2023-09-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：668-673