人RAF1-RAS结合域蛋白的纯化及功能验证

摘要：

目的 纯化人RAF1(RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase)-RAS(rat sarcoma)结合域(RAF1-RAS binding domain,RAF1-RBD)蛋白并验证其功能.方法 采用PCR法以人乳腺文库cDNA为模板扩增获得RAF1-RBD序列,将其插入至大肠杆菌表达载体pGEX-KG(带GST标签),获得pGEX-KG-RAF1-RBD重组质粒;转化该质粒至感受态细菌BL21(DE3),小量诱导并通过Western印迹法检测其表达;然后采用GST微珠纯化该蛋白;利用GST pull-down技术验证其与HRAS(Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog)蛋白相互作用.结果 双酶切鉴定及基因测序结果均表明成功构建重组质粒pGEX-KG-RAF1-RBD;Western印迹分析及SDS-PAGE方法检测结果说明重组蛋白相对分子质量(Mr)约42000,与预期大小一致;GST pull-down技术证明RAF1-RBD与HRAS在体外能够结合.结论 纯化的人RAF1-RBD蛋白与HRAS在体外存在相互作用.

关键词：人RAF1-RBD蛋白、原核表达、纯化、HRAS、蛋白相互作用

所属期刊栏目：43

分类号：R392-33;Q782

资助基金：全军医学科技青年培育计划孵化项目16QNP029;全军医学科技青年培育计划培育项目17QNP040

在线出版日期：2019-08-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：183-187