人Cdc25 B基因启动子报告基因载体的构建及转录活性分析

摘要：

目的 构建人细胞分裂周期25家族蛋白B(Cdc25B)基因启动子(promoter)荧光素酶报告基因载体pGL3-Cdc25B-promoter,并检测其转录活性.方法 应用欧洲启动子在线数据库(EPD)获得人Cdc25B基因5′端非编码区处包含转录起始位点在内的-2000～+100的DNA序列.以正常人全血基因组DNA为模板,利用PCR扩增该序列,并插入到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体上.通过设计不同引物,进一步构建系列缺失体,共获得7个不同长度启动子序列的报告基因载体.将其与内参质粒pRL-TK瞬时共转染HeLa细胞,通过双荧光素酶报告基因活性测定实验检测不同缺失体的转录活性.利用定点突变及RNA干扰(RNAi)探究预测的转录因子对Cdc25B转录活性的影响.结果 构建的人Cdc25B基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-Cdc25B-promoter经酶切鉴定及测序结果比对完全正确,将其转染HeLa细胞后,检测到荧光素酶高表达(P<0.05).启动子系列缺失分析显示-160～-53片段包含基本核心启动子,与生物信息学的预测结果一致.定点突变及RNA干扰显示NF-YB转录因子对Cdc25B起正调控作用.结论 成功构建了7个具有转录活性的人Cdc25B启动子缺失片段,确定了NF-YB是Cdc25B转录的一个重要调控因子,为进一步将其用于抗肿瘤药物的筛选与评价奠定了基础.

关键词：Cdc25B基因、启动子、转录因子、碱基序列、聚合酶链反应

所属期刊栏目：42

分类号：Q78(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家自然科学基金资助项目31770907,31640022;北京市自然科学基金资助项目7172146

在线出版日期：2018-08-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：261-265,270