利用CRISPR／Cas方法建立RNase L基因稳定敲除细胞株

摘要：

目的：利用CRISPR／Cas9技术建立人RNase L基因稳定敲除的细胞株。方法根据GenBank中RNase L基因序列，设计RNase L敲除的小指导RNA（ sgRNA）序列，将其克隆到pCas-Guide真核表达载体中，获得pCas指导RNA（ gRNA）载体；设计供体DNA的同源臂序列，通过搭桥PCR将左同源臂、潮霉素B抗性基因和右同源臂扩增成为一条片段作为同源重组的修复模板，并将其克隆到pBackZero-T表达载体上，获得pBackZero-T-RNase LK载体。将上述两个载体共转染HEK293细胞，用潮霉素B筛选，通过Western印迹和DNA测序等技术验证RNase L从基因组上敲除。结果与结论成功构建了载体pCas-gRNA和pBackZero-T-RNase LK，Western印迹和DNA测序结果表明，成功获得5株RNase L缺失的细胞株，为探讨RNase L的生物学功能和研究其分子机制奠定了基础。

关键词：CRISPR/Cas技术、RNase L、小鼠、基因敲除、同源重组、内切核糖核酸酶类、转染、潮霉素B

分类号：Q784;Q556(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家自然科学基金资助项目31270836，31370760；国家高技术研究发展计划资助项目2012AA022501；国家重点基础研究发展计划资助项目2013CB910801

在线出版日期：2015-11-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：742-746