10.7644/j.issn.1674-9960.2015.07.003
DEK基因RNAi慢病毒表达载体的构建及其功能鉴定
目的:构建DEK基因的RNA干扰( RNAi)慢病毒表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法采用RNAi技术,根据DEK基因的序列,确定其有效靶序列,合成DEK基因的Oligo DNA,退火形成双链DNA,将其克隆到经BamHⅠ与EcoRⅠ酶切后的小干扰RNA( siRNA)表达载体PSIH-H1上,产生PSIH-H1-DEK慢病毒载体,筛选阳性克隆并测序鉴定。与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染乳腺癌细胞ZR75-1,经嘌呤霉素( puromycin,puro)筛选2周后,收集部分细胞利用实时聚合酶链反应( real time-PCR,RT-PCR)和Western印迹分别检验DEK在信使RNA ( mRNA )和蛋白水平的敲低效果,并通过细胞生长实验检测DEK对人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞生长的影响。结果 PCR和DNA测序结果证实,DEK siRNA慢病毒表达载体PSIH-H1-DEK构建成功。 RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的DEK siRNA可有效抑制DEK基因的表达,并由此建立了敲低DEK的稳定克隆。生长曲线实验表明, DEK siRNA可抑制人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞的生长。结论成功构建了DEK基因的RNAi慢病毒表达载体,感染人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞后,有效沉默了ZR75-1细胞中的DEK基因的表达,为进一步研究DEK基因在乳腺癌中的作用奠定基础。
DEK基因、RNA干扰、慢病毒载体、乳腺肿瘤、人乳腺癌细胞ZR75-1、基因表达、质粒、转染
R737.9(肿瘤学)
国家自然科学基金资助项目81272231;北京市自然科学基金资助项目7132143
2015-08-13(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)
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