重组人蛋白C在CHO/dhfr+细胞中的表达与分析

摘要：

目的:人蛋白C具有重要的抗凝功能,与复发性血栓性疾病、蛋白C缺陷症、创伤等有重要关系.血源蛋白C成本高、工艺复杂且存在纯度、稳定性、安全性等问题,研制重组人蛋白C具有必要性.目前尚无此类产品上市.本研究拟从人肝细胞中克隆蛋白C的cDNA,构建人蛋白C的哺乳动物细胞表达载体,实现重组人蛋白C在CHO/dhfr+中的表达.方法: 用RT_PCR从人胎肝细胞mRNA中扩增人蛋白C的全长cDNA片段,将之克隆入pGEM_T载体并测序.目的片段插入真核表达载体pIRESneo以构建重组表达质粒.磷酸钙共沉淀法转染CHO/dhfr+细胞,G418筛选抗性克隆.Western 印迹法检测细胞培养上清.Hitrap Q进行色谱纯化.表达产物经蛙蛇蛇毒激活后以APTT法测定抗凝活性.结果:RT_PCR扩增到长1*!386*!bp的DNA片段,序列与已报道的人蛋白C一致.所构建的表达质粒pIREShPC转染CHO/dhfr+细胞,经G418加压筛选得到7株表达细胞.Western印迹法检测发现表达产物能与抗人蛋白C单克隆抗体结合,相对分子质量与人蛋白C一致.Hitrap Q纯化重组蛋白回收率＞60%.表达产物抗凝活性略低于天然人蛋白C.

关键词：蛋白质C、基因表达、重组蛋白质量、抗体、单克隆

所属期刊栏目：26

分类号：Q786(基因工程（遗传工程）)

在线出版日期：2004-01-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：102-104,108