1α羟化酶的真核表达和生物信息学特征及其在成年肉鸡组织中的差异表达

摘要：

旨在构建1羟化酶(CYP27C1)真核表达载体,在293T细胞中重组表达CYP27C1-mycHis,探究cyp27c1基因在成年鸡不同组织中的表达水平,明确1α-羟化酶三级结构特征、与底物识别和活性中心底物结合相关的关键氨基酸.将合成的cyp27c1的开放阅读框(ORF)插入pMD18-T质粒,并将该质粒命名为pMD-cyp27c1.以改造后的质粒为模板,通过PCR扩增cyp27c1 ORF,将其插入pcDNATM 3.1,构建真核表达载体pcDNA-cyp27c1.然后分别用pcDNA-cyp27c1及空载体pcDNA瞬时转染293T细胞,48 h后收集细胞,提取线粒体,用Bradford法测定蛋白质的质量浓度.1μg线粒体用于12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,以myc抗体作为一抗检测重组CYP27C1在293T细胞中的表达水平.利用实时荧光定量PCR检测cyp27c1在成年鸡组织中的表达水平.通过生物信息学分析CYP27C1的理化特性,并预测其亚细胞定位,利用同源建模、多序列同源比对和分子对接法研究CYP27C1的空间结构特征以及与底物(25-OH D3)结合和识别相关的关键氨基酸.测序结果显示,1608 bp编码区插入到pcDNATM3.1,并成功在其3′端融合了载体表达标签myc-His.在重组表达CYP27C1-mycHis的293T细胞线粒体中检测到相对分子质量为58000的特异性条带.实时荧光定量PCR结果表明,cyp27c1基因在鸡肝、肾、胸肌、腿肌、小肠、胸腺、脾、肾上腺、睾丸、卵巢等组织中均有表达,并且相对表达量存在组织差异性.cyp27c1基因编码1个由536个氨基酸组成的细胞色素P450,亚细胞定位于线粒体上,成熟蛋白质N-末端起始于V62.同源建模结果显示,CYP27C1中α螺旋、β折叠的氨基酸数量分别占蛋白质中总氨基酸数量的49.15％、5.90％,具有与其他线粒体细胞色素P450相似的开放式三级结构.多序列比对和分子对接结果表明,C482、R135与血红素形成较强的氢键;A136、K83是与25-OH D3识别的关键氨基酸;活性中心L343、D347是与25-OH D3结合的关键氨基酸.本研究成功构建了CYP27C1真核表达载体,并在293T细胞中超表达CYP27C1,确定了CYP27C1的三级结构和与底物识别及结合相关的关键氨基酸,为后续深入研究CYP27C1结构、功能和催化机制提供了基础.

关键词：鸡、细胞色素P45027C1、真核表达、生物信息学

所属期刊栏目：38

分类号：S831.9(家禽)

资助基金：陕西省教育厅专项科研计划项目;陕西理工大学人才启动项目

在线出版日期：2022-11-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共12页

页码：1286-1297