Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶重组腺病毒载体的构建、鉴定及初步应用

摘要：

目的: 构建携带Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶(PKGⅡ)基因的重组腺病毒载体,并以此初步研究PKGⅡ对增殖相关的MAPK信号转导的影响.方法: 将PKGⅡ cDNA片段自载体pRC/CMV-GKⅡ(wt)中切出,克隆至穿梭质粒pENTR 1A,用ClonaseⅡ将pENTR-PKGⅡ中的PKGⅡ cDNA片段定向克隆到pAd/CMV/V5-DEST中构建pAd/CMV/V5-DEST-PKGⅡ(Ad-PKGⅡ).重组质粒Ad-PKGⅡ用PacⅠ酶酶切,使其线性化,再用脂质体转染法转染HEK293A细胞进行包装和扩增,微量全细胞病变法检测病毒滴度,蛋白质印迹法检测重组腺病毒Ad-PKGⅡ感染细胞后PKGⅡ的表达以及MAPK通路关键成分胞外信号调节激酶(ERK)活性的变化.结果: 重组腺病毒滴度达5×109 pfu/ml,蛋白质印迹法检测显示重组腺病毒感染CS54细胞后使其PKGⅡ表达明显增高;在BGC-823胃癌细胞株, PKGⅡ对EGF导致的ERK的激活有明显抑制作用.结论: 成功构建了携带PKGⅡ基因的重组腺病毒,初步证明PKGⅡ对细胞增殖相关信号转导有抑制作用,为进一步研究PKGⅡ与肿瘤细胞发生发展的关系提供了基础.

关键词：Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶、腺病毒载体、DNA重组、胞外信号调节激酶

所属期刊栏目：20

分类号：Q257(细胞生理学)

资助基金：江苏省自然科学基金资助项目BK2007091

在线出版日期：2010-03-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：36-39,51