类人胶原蛋白基因COL6A2的克隆及其在大肠杆菌中的表达

摘要：

根据GenBank上查到的人胶原蛋白序列COL6A2（NM058175.2），利用Primer 5设计特异性引物，以吉林农业大学生物物理实验室构建的重组质粒pCMV-Sport6-COL6A2为模板进行目的基因的克隆，获得目的基因COL6A2，然后用双酶切的方法连接目的基因COL6A2和表达载体pET32a，将连接产物转化到大肠杆菌中构建原核表达载体pET32a-COL6A2。再将鉴定成功的重组质粒pET32a-COL6A2分别转化到大肠杆菌BL21、BL21（DE3）、BL21（BE3）plysS及Rosetta（DE3）中，采用1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达，经12％SDS-PAGE电泳分析并筛选出重组蛋白表达量最高的菌株。利用Ni Sepharose 6 Fast Flow琼脂糖树脂亲和层析柱纯化重组蛋白。结果表明：获得了大小为570 bp的COL6A2片段，经测序鉴定序列正确；成功构建了pET32a-COL6A2原核表达载体并表达出约30 kD的目的蛋白；筛选出BL21（DE3）作为高效表达菌株，其重组蛋白表达量占菌体总蛋白的23.9％；经镍离子亲和层析纯化获得了纯度＞90％的目的蛋白。

关键词：胶原蛋白、重组载体、大肠杆菌、克隆、纯化

分类号：Q785;Q786(基因工程（遗传工程）)

资助基金：吉林省自然科学基金项目201115189

在线出版日期：2014-02-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：51-55,65